服务概述Service Overview
微生物基因组改造是合成生物学、微生物代谢工程、工业菌种改造的核心核心技术，依托同源重组/自杀质粒/CRISPR-Cas9等方法实行无痕敲除、定点敲入、点突变、基因过表达等精准编辑技术，对细菌、酵母、真菌等微生物基因组进行定向、精准的基因修饰。通过改造微生物关键功能基因，实现菌株代谢通路优化、产物产量提升、毒力基因敲除、抗性基因去除、底盘细胞构建等改造目的。
方法比较Method Comparison
| 对比维度 | Lambda Red法 | 自杀质粒法 | CRISPR/Cas9法 |
| 核心机制 | 噬菌体重组酶介导同源重组，不产生DSB | 宿主内源重组酶介导两轮同源重组 | Cas9核酸酶切割+DSB修复 |
| 同源臂长度 | 约50–70 bp | ≥1 kb | 30–100 bp（供体模板） |
| 重组效率 | 较高（提升10³–10⁴倍） | 低（通常<10⁻⁶） | 高（10%–100%） |
| 操作周期 | 约3-4周 | 4–6周 | 3-5周 |
| 宿主适用范围 | 主要限于大肠杆菌及部分肠杆菌 | 最广，适用于大多数原核微生物 | 较广，但受限于遗传转化体系 |
| 无痕编辑 | 存在几十bp碱基残留 | 可（天然无痕） | 可（需消除Cas9系统） |
| 多基因编辑 | 支持（可同时或连续编辑） | 较难（需多轮操作） | 最佳（多gRNA共表达） |
| 大片段整合 | 优势显著（>5 kb） | 可，但受质粒容量限制 | 受限于HDR效率 |
实验流程Experiment Procedure
Lambda Red 法
1
活化
→
2
诱导Red
→
3
感受态
→
4
转入DNA
→
5
重组培养
→
6
抗性筛选
→
7
单克隆
→
8
PCR/测序
→
9
保种
自杀质粒法
1
构建质粒
→
2
转化
→
3
抗性筛选(单交换)
→
4
无抗传代(双交换)
→
5
筛丢失质粒
→
6
划线纯化
→
7
鉴定
→
8
保种
CRISPR/Cas9 法
1
gRNA设计+载体
→
2
修复模板
→
3
转化
→
4
Cas9剪切+修复
→
5
抗性筛选
→
6
单克隆
→
7
测序+脱靶
→
8
(无痕去除)
→
9
保种
交付结果Deliverables
-
- 菌株成品交付
- 交付2-3支甘油保种菌株（20%甘油） + 新鲜平板菌落一份；菌株无杂菌污染、无支原体污染、生长性状稳定
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- 实验报告资料
- 项目实施方案、载体构建报告、PCR鉴定电泳图、测序峰图与序列比对结果
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